HPLC（高速液体クロマトグラフィー）は、複数成分からなる試料を分析するのに適した分析装置です。試料を定性・定量的に分析できるので、医薬品や食料品など多くの分析に利用されています。この記事では、HPLCの移動相の選び方について詳しく解説します。HPLCの移動相を購入する際は、分析計測ジャーナルにご相談ください。
HPLCでは、試料中の化合物のカラムに対する吸着力の違いを利用して分離を行います。固定相のカラムに対して、移動相である試料を溶かした溶媒の組成を時間依存的に変化させることで、試料とカラムの相互作用の強さを変化させることが可能です。これにより、試料中の複数成分を分離できます。
一般的には固定相として疎水性の逆相カラムを利用することが多いです。移動相としては、水系と有機溶媒系の混合溶媒を使用し、分析中はそれらの比率を変化させながら測定を行います。
逆相カラム
逆相カラムでは、シリカゲルにオクタデシル基が結合しているため、疎水性の試料をより強く吸着します。ある程度の疎水性を持つ試料の分析に適しています。溶媒は水系の比率が高い状態から、有機溶媒系の比率が高い状態にグラジエントをかけましょう。
順相カラム
順相カラムでは、シリカゲルの表面が極性基となっているため、親水性の試料をより強く吸着します。親水性の試料の場合、カラムを順相に変更することで測定がうまくいくこともあります。溶媒は有機溶媒系の比率が高い状態から、水系の比率が高い状態にグラジエントをかけると良いでしょう。
HPLCの移動相の選び方
HPLCでは移動相の選び方により、正しい分析を行えるのかどうかが決まります。水系溶媒としてよく利用されるのは、純水（MilliQ）です。有機溶媒としてはアセトニトリルやメタノールがよく用いられます。
あまりメジャーではありませんが、IPA（イソプロパノール）やアセトンなども有機溶媒として使用されることがあります。
ファーストチョイスはアセトニトリル/水
HPLCにおける移動相のファーストチョイスは、アセトニトリル/水の混合溶媒です。逆相HPLCでは、溶媒を流した直後にDMSOなどの不純物のピークがよく現れます。試料の水溶性が高く、リテンションタイム（保持時間）が短くて不純物のピークと被る場合は、溶媒のグラジエントを調整しましょう。この図のように、最初の数分間は水の割合を高く維持し、その後緩やかにグラジエントをかけることで、水溶性の高い試料でも綺麗に分析を行えます。
セカンドチョイスはメタノール/水
しかし、試料の水溶性があまりにも高い場合、そのままではうまく分析を行えないこともあります。その場合は、有機溶媒をアセトニトリルからメタノールに変更しましょう。メタノールはアセトニトリルに比べて極性が高い溶媒なので、高い水溶性を持つ試料の測定に適しています。
アセトニトリルとメタノールを徹底比較
メタノールは試料の水溶性が高い場合において便利であると解説しました。ここからは両者の違いについて更に詳しく説明します。
アセトニトリルを使用するメリット
アセトニトリルを使用するメリットは、主にこの2つです。
- カラム圧を過度に上げずに済む
- 試料ピークが鮮明に得られる
カラム圧を過度に上げずに済む
アセトニトリルは水と混合しても、粘度の変化があまりありません。一方で、メタノールは混合溶液中で粘度が大きく変化します。粘度が大きくなると、それに伴って圧力が上昇します。カラム中の圧力の上昇は危険ですが、アセトニトリルを使用することでそのリスクを抑えられます。
試料ピークが鮮明に得られる
HPLCでは、特定の波長の光に対する試料を溶かした溶液の吸収の強さを測定することで分析を行います。高グレードのアセトニトリルの紫外光に対する吸収特性は、メタノールと比較すると弱いです。したがって、アセトニトリルではバックグラウンドピークを抑えられ、より鮮明に試料ピークを観測できます。
先ほど述べたように、アセトニトリルは溶媒のグレードにより、吸収特性が大きく異なります。アセトニトリルをHPLC分析で用いる場合は、HPLCグレードの溶媒を使用しましょう。一方で、メタノールの吸収特性はグレードによってあまり変わらないので、グレードを気にする必要がそれほどありません。
メタノールを使用するメリット
メタノールを使用するメリットは、主にこの2つです。
- コストが安い
- 極性化合物のテーリングを抑えられる
コストが安い
高グレードのアセトニトリルは紫外光の吸収特性を抑えられるため、非常に便利です。しかし、その分高価です。メタノールは高グレードのアセトニトリルと比較して安価なので、コストを抑えてHPLC分析を行えます。
極性化合物のテーリングを抑えられる
アセトニトリルで極性化合物の分析を行うと、ピークがテーリングすることがあります。しかし、メタノールはアセトニトリルに比べて極性化合物をより溶解させられるので、極性化合物の測定に適しています。
移動相に酸を添加するのはなぜ？
HPLC分析で移動相をそのまま使用すると、分析が上手くいかないことがあります。例えば、化合物のピークがテーリングすることもあります。その場合、移動相に酸を添加すると良いでしょう。
塩基性化合物のカラムへの吸着を抑制できる
シリカゲル表面に存在するシラノール基は、弱酸性の官能基です。そのため、中性溶媒中ではその一部がプロトンを遊離し、イオン型として存在します。イオン型のシラノール基は塩基性化合物を強く吸着するため、HPLC分析中のテーリングの原因となり得ます。しかし、溶媒に酸を添加することでシラノール基の遊離を抑えられるので、テーリングを抑制可能です。
酸性化合物の平衡を偏らせるため
酸性化合物は中性溶液中で、分子型とイオン型が混合した状態で存在します。しかし、溶媒に酸を添加することで、その平衡を分子型の方向に偏らせることができます。分子型はほどよく逆相カラムに吸着するので、酸性化合物は溶媒に酸を添加することで分離能が改善する場合があります。
ギ酸・TFAがファーストチョイス
HPLCの移動相に添加する酸として、ギ酸とTFA（トリフルオロ酢酸）がよく用いられます。TFAのpKaは約-0.2で、ギ酸のpKaは約3.8です。0.1%TFA水溶液のpHは約2.0、0.1%ギ酸水溶液のpHは約2.7となります。試料のpKaにあわせてこれらの酸を使い分けるのが良いでしょう。
HPLCの移動相はグレードに注意
HPLC分析では、化合物の溶媒に対する溶解性を見極めて適切な溶媒を使用することが重要です。HPLCグレードのアセトニトリル溶媒は高価ですが、メタノールに比べて溶媒のバックグラウンドの影響が小さいため、より鮮明なピークを得られます。測定がうまくいかない場合は、化合物の物性を考慮して溶媒に酸を添加してみるのも良いでしょう。分析ジャーナルでは、HPLCの溶媒の紹介も行っているので、お気軽にご相談ください！
